--- title: "Idée reçue #7: \"Les systèmes cell-free ne fonctionnent qu'avec des plasmides.\"" description: Les systèmes cell-free fonctionnent aussi bien avec des plasmides qu'avec des fragments PCR. image: https://blog.synthelis.com/hubfs/bacterial%20protein%20(1).jpg --- [![](https://no-cache.hubspot.com/cta/default/4655509/af303854-a240-4550-a134-b1ac7f4aac03.png)](https://cta-redirect.hubspot.com/cta/redirect/4655509/af303854-a240-4550-a134-b1ac7f4aac03) [![Synthelis](https://blog.synthelis.com/hs-fs/hubfs/Synthelis_June2018_Theme/Images/logo.png?width=181&height=90&name=logo.png "Synthelis")](http://www.synthelis.com/) - [Twitter](https://twitter.com/Synthelis) - [Linkedin](https://www.linkedin.com/company/synthelis) - [RSS](http://www.synthelis.com/feed/) - [Contact](http://www.synthelis.com/contact/) - [Technology](http://www.synthelis.com/cell-free-technology/) - [Cell-Free for Membrane Proteins](http://www.synthelis.com/cell-free-technology/cell-free-for-membrane-proteins/) - [Cell-Free for soluble proteins](http://www.synthelis.com/cell-free-technology/cell-free-for-soluble-proteins/) - [Proteins inserted into a proteoliposome](http://www.synthelis.com/cell-free-technology/proteins-inserted-into-a-proteoliposomes/) - [Applications](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/) - [Vaccine development](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/vaccine-development/) - [Antibody development](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/antibody-development/) - [Screening & display technologies](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/screening-display-technologies/) - [Protein delivery](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/protein-delivery/) - [In vitro Diagnostics -IVD](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/in-vitro-diagnostics/) - [Structural Biology](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/structural-biology/) - [Solutions](http://www.synthelis.com/services-cell-free/) - [Products](http://www.synthelis.com/protein-catalogue/) - [Services](http://www.synthelis.com/services-cell-free/) - [Blog & News](https://blog.synthelis.com/) - [Blog](https://blog.synthelis.com/) - [News](https://www.synthelis.com/ressources/news/) - [Events](http://www.synthelis.com/synthelis-events/) - [Ressources](http://www.synthelis.com/publications/) - [About](http://www.synthelis.com/about/) - [Our Management](http://www.synthelis.com/about/synthelis-team/) - [Our History](http://www.synthelis.com/about/history/) - [Our Investors](http://www.synthelis.com/about/investors/) - [Our Clients](http://www.synthelis.com/about/clients/) - [Our Partners](http://www.synthelis.com/about/institutional-partners/) - [Our Distributors](http://www.synthelis.com/about/our-distributors/) - [They talked about us](http://www.synthelis.com/about/they-talked-about-us/) - [Contact](http://www.synthelis.com/contact/) - [Synthelis](http://www.synthelis.com/) - [Blog Synthelis France](https://blog.synthelis.com/fr) - Idée reçue #7: "Les systèmes cell-free ne fonctionnent qu'avec des plasmides." # Idée reçue #7: "Les systèmes cell-free ne fonctionnent qu'avec des plasmides." [Vous avez d'informations ? demander à être rappelé](https://blog.synthelis.com/request-a-call-back) # Idée reçue #7: "Les systèmes cell-free ne fonctionnent qu'avec des plasmides." Posted by [Bruno Tillier](https://blog.synthelis.com/fr/author/bruno-tillier) on Jul 9, 2019 3:27:22 PM ![Bruno Tillier](https://blog.synthelis.com/hubfs/Bruno-synthelis-1.jpg) - [Tweet](https://twitter.com/share) La synthèse protéique cell-free fonctionne avec du **matériel génétique tel que l'ADN plasmidique** mais elle peut également être réalisée à partir **de séquences d'ADN linéaires amplifiées par PCR**. Lors des premiers essais d'expression cell-free à partir de fragments PCR, il est vrai que les rendements d'expression étaient beaucoup plus faibles que ceux issus d’ADN plasmidique. Ceci était dû **à l'activité DNase**, présente dans l'extrait issu de cellules bactériennes, qui **diminuait la durée de vie de l'ADN linéaire**.  Néanmoins,  comme la production de protéines à partir de **fragments PCR** offrait des **perspectives de grande rapidité,** en raison de l'élimination des étapes de clonage, de criblage et de sélection, **plusieurs approches** ont été étudiées pour **améliorer la productivité en réduisant la dégradation linéaire de l'ADN ou en stabilisant l'ARNm** (Lee et al., 2018 ; Schinn et al. 2016). **Aujourd’hui, les systèmes cell-free obtiennent des rendements similaires à partir d’ADN plasmidiques comme de fragments PCR.** L'une de ces approches a consisté à **retirer le gène codant** pour l'endonucléase I et l'exonucléase V, deux nucléases majeures agissant sur l'ADN double brin du génome de la souche *E. coli* utilisée pour la préparation des extraits cellulaires (Michel-Reydellet et al., 2005). Dans cette approche, le gène endA codant pour l'endonucléase I a été supprimé et l'opéron recCBD, qui fait partie du système de recombinaison d’*E. coli* et code pour l'exonucléase V, a été remplacé par **le système de recombinaison du phage lambda Red**. Ces modifications génétiques n’ont pas affecté le taux de croissance bactérienne et elles se sont **traduites par une nette augmentation de la stabilité** du produit PCR. Ainsi, la chloramphénicol acétyltransférase (CAT) a, par exemple, pu être produite avec des **rendements de 500 à 600 µg/mL à partir de fragments PCR** ; rendements similaires à ceux obtenus à partir  de plasmides recombinants. D'autres approches utilisant des ADN linéaires ont également permis d'améliorer cette productivité: **l'ajout de la protéine Gam** du bactériophage lambda, par exemple ou **l’utilisation d’un inhibiteur de la protéine RecBCD** (Sitaraman et al., 2004) ou encore **l'introduction de chi-sites dans l'ADN linéaire**. Comme la RecBCD s'arrête sur les chi-sites d'ADN dans le cadre de la recombinaison homologue (Marshall et al., 2017), les deux stratégies ont augmenté **la stabilité de l'ADN linéaire** dans l'extrait cellulaire bactérien. Une approche encore différente vise à **prolonger la durée de vie de l'ARNm pour augmenter la productivité** lors de l'utilisation de fragments PCR. En préparant un extrait cellulaire, dépourvu d'activité RNase E et en introduisant une structure en boucle à l'extrémité 3' de l'ARNm (Ahn et al., 2005), l'ARNm a été protégé des endonucléases et des exonucléases, la demi-vie de l'ARNm a ainsi considérablement augmenté et sa traduction s'est produite malgré la dégradation rapide du modèle ADN. Au final, **la CAT a été produite à 685 µg/mL, un rendement comparable** à celui observé lors de **l'utilisation d'ADN plasmidique.** Ainsi, les stratégies ayant permis **la stabilisation des fragments PCR** ont permis leur utilisation dans les systèmes cell-free, **sans perte de rendement**, rendant ces derniers extrêmement **performants et rapides pour l’expression haut débit** de banques de gènes ou de librairie de mutants, sans avoir à passer par les étapes de biologie moléculaire de sous-clonage, de sélection, d’amplification et de purification de constructions plasmidiques. Il en résulte qu’un **grand nombre de protéines** peuvent à présent être rapidement produites à partir **de fragments PCR linéaires**, dans de très petits volumes réactionnels,  tels que des **plaques au format 384 puits**. Ces protocoles peuvent être automatisés à l'aide de robot de manipulation de liquides mais peuvent également être exécutés manuellement tout en offrant un débit d’expression élevé. ![synthelis-our-services](https://blog.synthelis.com/hs-fs/hubfs/synthelis-our-services.jpeg?width=350&name=synthelis-our-services.jpeg)   **Auteurs & Sources:** Ahn J.H., Chu H.S., Kim T.W., Oh I.S., Choi C.Y., Hahn G.H., Park C.G., Kim D.M. 2005. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications 338:1346–1352. Lee K.H., Kim D.M. 2018. Recent advances in development of cell-free protein synthesis systems for fast and efficient production of recombinant proteins. FEMS Microbiology Letters 365(17):1-7. Marshall R., Maxwell C.S., Collins S.P., Beisel C.L., Noireaux V. 2017. Short DNA containing chi sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering 114:2137–2141. Michel-Reydellet N., Woodrow K., Swartz J. 2005. Increasing PCR Fragment Stability and Protein Yields in a Cell-Free System with Genetically Modified Escherichia coli Extracts. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 9:26–34. Schinn S.M., Broadbent A., Bradley W.T., Bundy B.C. 2016. Protein Synthesis Directly from PCR: Progress and Applications of Cell-Free Protein Synthesis with Linear DNA. New Biotechnology 33(4):480-7. Seki E., Matsuda N., Yokoyama S., Kigawa T. 2008. Cell-free protein synthesis system from Escherichia coli cells cultured at decreased temperatures improves productivity by decreasing DNA template degradation. Analytical Biochemistry 377:156–161. [Sitaraman K](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Sitaraman%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15163516)., [Esposito D](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Esposito%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15163516)., [Klarmann G](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Klarmann%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15163516)., [Le Grice S.F](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Le%20Grice%20SF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15163516)., [Hartley J.L](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hartley%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15163516)., [Chatterjee D.K](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Chatterjee%20DK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15163516). 2004. A novel cell-free protein synthesis system. [Journal of Biotechnology.](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15163516) 110(3):257-63. Topics: [Cell-free technology](https://blog.synthelis.com/fr/tag/cell-free-technology), [Proteins](https://blog.synthelis.com/fr/tag/proteins) ### Sujets - [Cell-free technology (2)](https://blog.synthelis.com/fr/tag/cell-free-technology) - [Proteins (2)](https://blog.synthelis.com/fr/tag/proteins) ### Derniers articles ### Abonnez vous à notre blog [![Synthelis](https://blog.synthelis.com/hubfs/Synthelis_June2018_Theme/Images/logo-footer.png)](http://www.synthelis.com/) - [Facebook](https://www.facebook.com/synthelis) - [Twitter](https://twitter.com/Synthelis) - [Linkedin](https://www.linkedin.com/company/synthelis) - [RSS](http://www.synthelis.com/feed/) - [Contact](https://blog.synthelis.com/request-a-call-back) - [Cell-Free Technology](http://www.synthelis.com/cell-free-technology/) - [Applications](http://www.synthelis.com/fields-of-application-for-membrane-proteins/) - [Services](http://www.synthelis.com/services-cell-free/) - [Products](http://www.synthelis.com/products/) - [Synthelis](http://www.synthelis.com/about/) - [News & Events](http://www.synthelis.com/ressources/news/) - [Resources](http://www.synthelis.com/publications/) - [Privacy policy](http://www.synthelis.com/privacy-policy/)